بررسی تکنیک های ملوکولی (PCR)

[scorpion_tur]

PCR چیست؟

Polymerase Chain Reaction

ü تکنیکی آزمایشگاهی برای تکثیر اختصاصی توالی های اسید نوکلئیک
ü کری مولیس 1987
ü انقلاب علوم بیولوژی مولکولی





اصول:

ü تک رشته‌ای شدن و اتصال مجدد

مراحل:

ü تک رشته‌ای شدن

ü اتصال

ü تکثیر


استاندارد مواد در واکنش های PCR:

1-Thermostable DNA Polymerase Enzyme ; ( 0.5-2 u)

2-Dinucleoside Threephosphates (dNTPs) (100-200 ųM of each /ml)

3-MgCl2 ; Cofactor for DNA polymerase (0.5-5 mM/ml)

4-Buffer;

10 mM Tris-HCl pH=8.3 (25 °C) 50 mM KCl

1.5 mM MgCl2 0.01 % Gelatin

5- Template ; (< 1pg- 100 ng)

6- Primer; (0.1-1 ųM/ml)


ترکیب مواد در واکنش های PCR:
PCR Buffer 10X: 2 µl

• Each dNTPs: 250 µM

• MgCl2: 2 mM

• Each Primer: 0.5 µM

• Taq DNA Polymerase: 1 U

• Target DNA: 1 µl (100 ng)


وسیله تکثیر:

ü دستگاه ترموسایکلر

برخی از روشهای PCR:

• Hot-Start PCR

• Nested-PCR

• ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System)

• Multiplex PCR (Co-Amplification)

• Touchdown PCR

• PCR-SSCP

• PCR-RFLP

• AND …

برخی کاربردهای PCR:

ü تولید انبوه از قطعه مورد نظر (تولید ماده اولیه برای سایر آزمایشات)

ü تعیین ژنوتیپ (PCR-RFLP, PCR-SSCP, ARMS-PCR)

ü تشخیص بیماریهای ژنتیکی و عفونی

آزمایشگاه بیوتکنولوژی

1) بخش بیو انفورماتیک

2) بخش عملیات میدانی (جمع آوری نمونه)

3) بخش استخراج DNA

4) بخش PCR

5) بخش الکتروفورز

6) بخش نرم افزار (تحلیل داده ها)

7) بخش ضد عفونی (استفاده از اشعه U.V)

کاربردهای PCR در دامپزشکی

ü تشخیص بیماری هایی از قبیل سل، یون، تب مالت، آنفولانزای حاد پرندگان و ... .

ü تشخیص تقلبات گوشت چرخ کرده، سوسیس و کالباس (استفاده از روش Multiplex PCR)

ü تشخیص تقلبات پودر ماهی

ü تشخیص سویه های جدید و بومی بیماریزا

روشهای مولکولی

ü مبتنی بر توالیهای اختصاصی DNA

ü لزوم شناسایی توالیهای اختصاصی در ژنومMap

ü مزایای PCR:

ü سرعت عمل

ü عدم نیاز به انجام آزمایش تأییدی (دقت بیشتر)

ü هزینه کم تر